PCR引物设计中primer5的使用方法（pcr引物的要求）-小美百科

大家好，关于PCR引物设计中primer5的使用方法很多朋友都还不太明白，不知道是什么意思，那么今天我就来为大家分享一下关于pcr引物的要求的相关知识，文章篇幅可能较长，还望大家耐心阅读，希望本篇文章对各位有所帮助！

1如何设计primer-如何如何使用primerprimer设计引物

先下载好primer premier0软件，按注册机提示激活该软件，然后双击打开该软件。如下图示然后进入NCBI数据库里面选择自己需要设计引物的基因，然后查找到该基因的DNA序列。

选择上方的红蓝双向箭头的按钮进行引物设计，在设计开始前可以更改设计的参数，包括搜索的碱基范围、引物的长度，碱基数，设计结果显示的引物对数等。设置完参数后，点击下方的Search，软件开始分析设计，完成后，点击OK。

设定Sense primer和Antisense primer的范围及PCR产物大小范围——设定引物长度（primer length）——Automatic——OK——Search complete后点OK——在Search Results里选择引物对。

1、引物长度，20bp；Tm值可以设置在55度（实验的时候可以用60度退火）；产物长度，100-150bp（如果没有合适的引物，产物长度可以设置在80-200）。

2、主要有五个要设置的地方，如下图红箭头标示。第一个地方是选择设计PCR引物，测序引物和杂交探针，如果要做PCR就选第一个圈圈“设计PCR引物”。

3、选你需要的就可以了。(有评分)。如要克隆基因，则在primer菜单下手动设计。

4、引物设计参数：a 引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。

5、首先设计引物以前的清楚设计引物基本原则例如测序使用引物：测序用引物要求非常严格，不同于PCR用引物。

6、方法是：打开Primer5软件，进入Design界面。在Design界面中输入所需的序列信息，包括起始位点和终止位点等。点击Options按钮，在弹出的对话框中选择PrimerTm选项卡。在PrimerTm选项卡中，看到目前设定的引物Tm值。

引物长度，20bp；Tm值可以设置在55度（实验的时候可以用60度退火）；产物长度，100-150bp（如果没有合适的引物，产物长度可以设置在80-200）。

而测序用引物便不一样了，必须严格符合以下要求。

如果你要扩展的基因已经测序完成，你在网上找到序列，输入primer5，然后点primer就可以了，然后你可以手动或自动更改，知道达到的你的要求。

PCR引物设计的11条黄金法则引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。可以使用oligo6或者primer5等软件设计。

首先打开NCBI，选择“Nucleotide”，并在搜索框输入基因名。一般用目标基因的突变体1去设计引物，也就是要选择目标基因的“transcriptvariant1，mRNA”，没有1就用3，以此类推。

1、如果不放心的话可以在增加几个nt，提高tm到60，也就是了。不过这真的不关键，毕竟可以做gradient PCR的。

2、点击File下拉菜单，选择New，然后选择DNASequence 从word文件中copy目标序列，然后control+V到primer5的文本框中，选择Asis，点击OK。

3、Tm值可以设置在55度（实验的时候可以用60度退火）；产物长度，100-150bp（如果没有合适的引物，产物长度可以设置在80-200）。如需设计引物，可以微信搜索“为青生物”，由***人员提供免费的荧光定量PCR引物设计服务。

4、做Real Time时，用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：1)避免重复碱基，尤其是G.2)Tm=58-60度。

5、正常primer5设计引物时，Tm在40~70之间都没有问题，基本在PCR时候按照引物合成公司给的TM值进行试验，都没有问题！除非你的引物设计的有问题。

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